2024年6月21日，復旦大學袁正宏/占昌友團隊在期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》上發表題為" Optimized RNA interference therapeutics combined with interleukin-2 mRNA for treating hepatitis B virus infection "的研究論文。
文獻中設計了一種針對HBV的siRNA序列組合(siHBV)，并利用艾特森微流控制備儀制備了一種改良脂質納米粒(tLNP)，實現了siHBV體內高效、安全、肝細胞靶向輸送。
研究背景
HBV感染所致慢性乙肝缺乏有效治療手段，現有藥物難以實現功能性治愈，RNAi技術雖具治療潛力，但受限于siRNA設計難度、遞送系統缺陷及無法激活抗病毒免疫，而IL-2可調控HBV特異性T細胞功能，為此本研究探索了優化的RNAi療法聯合IL-2 mRNA的抗HBV 策略。
1. 全基因組篩選靶向HBV的多功能高保守siRNA
首先，研究團隊通過分析超萬條HBV基因組序列篩選出保守基序，設計并合成20 條靶向全基因組的siRNA并分型，再利用不同HBV細胞模型進行干擾效率驗證，證明了僅HBV基因組特定區域的siRNA能同時靶向cccDNA和整合型HBV來源的轉錄本，且篩選出的候選siRNA干擾效果優于經典RNAi藥物ARC-520的靶向序列。
圖例1：全基因組篩選靶向HBV的多功能高保守siRNA
2. 篩選泛基因型多功能siRNA組合并完成化學修飾
在此基礎上，研究團隊通過評估不同siRNA組合的保守性與抗HBV活性，選定基因型覆蓋率98.55%的si1260與si1848組合為siHBV，經細胞實驗驗證其對不同基因型HBV的抑制作用后，對siHBV進行2'-OMe、2'-F等化學修飾并篩選，證明了優化修飾后的siHBV在保留高干擾活性的同時，血清穩定性顯著提升且細胞毒性極低。
圖例2：篩選泛基因型多功能siRNA組合并完成化學修飾
3. 優化低抗原性、肝靶向性的LNP遞送系統
隨后，研究團隊針對siRNA遞送難題，通過替換傳統PEG脂質為HO-PEG????-DMG并調整摩爾配比制備多款LNP，檢測其理化性質后，以Cy5標記siRNA和siApoB為模型開展體內外實驗，證明了3%HO-PEG????-DMG修飾的tLNP可減少免疫細胞脫靶攝取，實現siRNA的高效肝靶向遞送，且遞送效率優于傳統mPEG-LNP。
圖例3：優化低抗原性、肝靶向性的LNP遞送系統
4. 驗證tLNP/siHBV 的體外抑制效果與生物安全性
接著，研究團隊將優化后的tLNP與siHBV結合制備tLNP/siHBV，先通過體外細胞實驗檢測其對HBV抗原的抑制效果并計算IC50，再經全轉錄組測序、細胞因子檢測等實驗評估其安全性，證明了tLNP/siHBV能劑量依賴性抑制HBV表達，且脫靶效應極弱、無明顯免疫原性，生物安全性優異。
圖例4：驗證tLNP/siHBV的體外抑制效果與生物安全性
5.驗證tLNP/siHBV在rAAV-HBV1.3小鼠模型中的抗HBV活性
在完成體外驗證后，研究團隊在rAAV-HBV1.3慢性HBV小鼠模型中開展tLNP/siHBV單次及多次給藥實驗，檢測不同時間點血清病毒抗原、DNA水平，以恩替卡韋為陽性對照對比療效并監測小鼠生理及病理指標，證明了tLNP/siHBV能以劑量和時間依賴性顯著降低病毒載量和抗原水平，抗原抑制效果遠優于恩替卡韋，且動物耐受度良好。
圖例5：驗證tLNP/siHBV在rAAV-HBV1.3小鼠模型中的抗HBV活性
6. 驗證tLNP共遞送siHBV與mIL-2 mRNA的協同抗HBV效果
最后，研究團隊為進一步提升抗病毒效果并實現持久控制，構建mIL-2 mRNA并與siHBV共包封于tLNP制備聯合制劑tLNP/siHBVIL2，驗證其理化性質與mIL-2表達活性后，在HBV小鼠模型中開展給藥實驗，結合病毒指標檢測、流式細胞術及免疫組化分析肝臟免疫應答，證明了該聯合制劑可實現RNAi介導的抗原清除與IL-2誘導的HBV特異性T細胞激活的協同作用，顯著提升持久病毒控制效果。
圖例6：.驗證tLNP共遞送siHBV與mIL-2 mRNA的協同抗HBV效果
知識分享：研究亮點
1 篩選出基因型覆蓋率98.55%的泛基因型siHBV組合，可同時靶向cccDNA和整合型 HBV 來源轉錄本，經化學修飾后兼具高活性與高穩定性。
2 優化出低抗原性的tLNP遞送系統，以HO-PEG????-DMG替代傳統PEG脂質并調整配比，實現siRNA的高效肝靶向遞送，且生物安全性優異。
3 構建tLNP共遞送siHBV與mIL-2 mRNA的聯合療法，實現RNAi介導的病毒抗原清除與IL-2誘導的HBV特異性T細胞激活的協同作用，顯著提升抗HBV效果并實現持久病毒控制。
參考文獻：
Signal Transduction and Targeted Therapy ( IF 52.7 ) Pub Date : 2024-06-21 , DOI: 10.1038/s41392-024-01871-8
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